14. augustil 2015. a. kell 12.00 kaitses Kalle Pärn doktoriväitekirja "Studies on inducible alphavirus-based antitumour strategy mediated by site-specific delivery with activatable cell-penetrating peptides" ("Uurimus indutseeritava alfaviirusel põhineva kasvajavastase strateegia kohta, mis on vahendatud läbi aktiveeritavate rakku sisenevate peptiidide poolt võimaldatava kohtspetsiifilise kohaletoimetamise"). Juhendaja: prof Ülo Langel, prof Andres Merits (Tartu ülikool) Oponent: PhD Kenneth Herbert Lundstrom, PanTherapeutics, Šveits Kokkuvõte Alfaviirused on grupp lühikesi positiivse polaarsusega üheahelalisel RNA-l põhinevaid viiruseid, mille enimtuntud liikmete hulgas on Semliki Forest viirus, Sindbis viirus ning viimasel ajal ka Chikungunya viirus. Esimest kahte on tänu nende kiirele paljunemisele ja väiksele patogeensusele kasutatud juba aastaid, kuid tänu hiljutistele Chikungunya viiruse epideemiatele on intensiivsem uurimistöö laienenud ka selle viiruse valdkonda. Alates esimeste alfaviirustel põhinevate vektorite loomisest on neid rakendatud mitmete praktiliste ülesannete jaoks nii laboratoorseks uurimistööks kui ka meditsiinilistel eesmärkidel. Kuna alfaviiruste üheks omaduseks on oma peremeesrakk viiruse paljunemise tagajärjel apoptoosi suunata, on see omadus ravimitööstuses laialdast rakendust leidnud. Kuigi see omadus tundub esmapilgul kahjulikuna, saab seda rakendada kasvajate vastases ravis, lastes viirusel tuumorirakke hävitada ning samas väljutada nendest terapeutilisi molekule, mis on sünteesitud viiruse genoomi integreeritud transgeense järjestuse baasil. Käesoleva töö eesmärgiks ongi tegeleda kasvajate ravimise valdkonnaga, mis on praegu kaugel ideaalsest. Hetkel olemasolevad raviprotseduurid põhinevad peamiselt kirurgial, mille tagajärjel eemaldatakse küll kahjulik kude, kuid jääb püsima kasvaja uuesti tekkimise oht. Selle lisaks saab rakendada ka kiiritus- või kemoteraapiat, kuid mõlemad lähenemised võivad endaga kaasa tuua soovimatuid kõrvalnähte, mistõttu on oluline jätkata uuringutega uute kasvajavastaste lähenemiste välja arendamiseks, mis pakuksid patsientidele uusi võimalusi oma tervise taastamiseks ning lubaksid saavutada suurema raviefektiivsuse ja soovimatute kõrvalnähtude vähenemise. Antud töös uuritakse lähemalt kolme süsteemi, mis on üksteisega ühendatud läbi potentsiaalse praktilise rakenduse, mis kujutab endast efektiivse tuumoriteraapia süsteemi, millel on perspektiivi jõuda ka kliinilise rakenduseni. Esimeses uurimustöös pakuti välja kontrollmehhanism alfaviirustel põhinevate DNA/RNA-kihtvektorite jaoks, mis lubaks süsteemi kontrollida läbi ühe või enama defektse introni sisestamise regiooni, mis vastab viiruse genoomi mittestruktuursele lugemisraamile. Nakatamisvõimeliste RNA-de avaldumine nendelt konstruktidelt suruti edukalt maha, samas oli võimalik seda protsessi taastada läbi splaissingut korrigeerivate oligonukleotiidide rakendamise, mis võimaldavad ebakorrektse splaissingumustri korrigeerimist. Kuna intronit sisaldavad järjestused peavad põhinema DNA/RNA-kihtvektoril, mitte tavapärasel RNA genoomil, mis on viiruseosakesse pakitud, esineb nende konstruktide rakendamiseks suur vajadus efektiivse transfektsioonisüsteemi järele. Sellele probleemile keskenduti järgmises töös, milles hinnati paljulubava transfektsioonisüsteemi klassi, rakku sisenevate peptiidide, esindaja, PepFect6-e, sobivust sellisteks rakendusteks. Uurimuse peamiseks eesmärgiks oli peptiidipõhise ülekandesüsteemi omaduste hindamine kokkupuutel viirusel põhinevate järjestustega. Näidati, et rakku sisenevate peptiidide rakendamine viirusel põhinevate konstruktide rakku toimetamiseks omab märgatavat potentsiaali, kuna antud molekul suutis saavutada kõrgetasemelist rakkudesse toimetamise efektiivsust, omamata samal ajal mingit mõju viiruse nakatamisprotsessile ning mõjutamata viirusosakeste ning viirusel põhinevate vektorite paljunemise võimekust. Põhinedes sellel teadmisel, loodi rakku sisenevatel peptiididel põhinev tuumorispetsiifiline transpordistrateegia, mis oleks suuteline toimetama suuri plasmiide kasvajakudedesse. Selleks konstrueeriti peptiid, mis inaktiveeriti täielikult varjestusmolekuli PEG poolt, mis on rakku siseneva peptiidiga ühendatud läbi MMP2 geeniprodukti poolt lõigatava motiivi. Kuna MMP2 on geen, mis on kasvajarakkudes üleekspresseeritud, võimaldab see transfektsioonikompleksidel jääda inaktiivseks kehasse sisenemisel ning ainult muutuda aktiivseks juhul, kui nad puutuvad kokku spetsiiflise proteaasiga, mida leidub kasvajarakkudes, luues sedaviisi koespetsiifilise transpordisüsteemi. Põhinedes antud uurimistööle, saab välja pakkuda ohutu ning kasvajaspetsiifilise lähenemise kemoteraapiaks, mis koosneb kontrollitavast DNA viirusest ja/või DNA/RNA-kihtvektorist, mis ekspresseerib terapeutilist valku, mida oleks võimalik koos neid aktiveerivate splaissingut korrigeerivate oligonukleotiididega, tuumorispetsiifilise rakku siseneva peptiidi abil, selektiivselt tuumoritakkudesse toimetada. Selline süsteem võimaldaks koespetsiifilist rakkude apoptoosi viimist, mille lisandub ekspresseeritavatest terapeutilistest valkudest, mis vabanevad eelnevalt transfekteeritud/nakatunud rakkude hukkumise tagajärjel peremeesorganismi, tulenev resistentsus või kasvaja arengut pidurdav efekt.